onemocnění: pseudohypoparathyreóza (PHP)

Onemocnění PHP je charakterizováno rezistencí k parathormonu (PTH) a bývá způsobeno defektem v genu GNAS, který kóduje důležitou součást signální dráhy PTH (GSα podjednotku G proteinu). Dědičnost PHP je autosolmálně dominantní a v některých cílových tkáních PTH (např. distální tubuly v ledvinách) podléhá imprintingu, tj. protein GSα je zde exprimován pouze z maternální alely. Defekt této exprese vede v cílových tkáních k rezistenci na PTH a tím poškození metabolismu vápníku a fosforu. Ve zbytku těla je GSα exprimován z obou alel a pokles jeho aktivity v těle vede k fenotypu AHO (Albrightovy hereditární osteodystrofie). PHP dělíme na několik typů (Thiele et al 2016):

PHP1a - její příčinou jsou inaktivční mutace v maternální alele GSα, které vedou k poklesu aktivity GSα v cílových tkáních PTH i ve zbytku těla. Vyznačuje se tedy rezistencí k PTH i fenotypem AHO.

PHP1b - její nejčastější příčinou je ztráta metylace alt. promotoru genu GNAS (tzv. AB, aka 1A), často způsobená blízkými delecemi (např. v genu STX16). Tato ztráta metylace vede k narušení imprintigu, tj. k zablokování exprese GSα z maternální alely v cílových tkáních PTH, což vede k rezistenci na PTH. Ve zbytku těla zůstává exprese GSα beze změn, proto fenotyp AHO není přítomen. U sporadického PHP1b (asi 80% všech PHP1b) jsou přítomny ztráty metylace více alt. promotorů najednou.

PHP1c - její příčinou jsou mutace genu GNAS jen velmi vzácně. Jedná se o mutace v posledním exonu (13). Vzniká tak zkrácená verze proteinu GSα, který má aktivitu normální, ale jeho schopnost vázat se na receptor je v celém těle snížená (Thiele et al 2016). Vyznačuje se tedy rezistencí k PTH i fenotypem AHO.

- Pseudopseudohypoparathyreóza (PPHP)
Příčinou PPHP jsou mutace v paternální alele GSα. Exprese GSα v imprintovaných cílových tkáních PTH zůstává tedy nezměněna, proto nepozorujeme rezistenci k PTH. Ve zbytku těla je však aktivita Gsa snížená a je příčinou fenotypu AHO (Thiele et al 2016).

1. vyšetřované geny: GNAS ("Guanine Nucleotide Binding Protein, Alpha Stimulating")

Gen GNAS je komplexní lokus, který obsahuje 5 různých promotorů. Vzniklé transkripty se liší většinou pouze exonem 1, exony 2-13 mají společné. Hlavním produktem je protein GSα (α podjednotka proteinu G), který se účastní aktivace adenylát cyklázy prostřednictvím hormonu PTH a hraje tak důležitou roli v metabolismu vápníku a fosforu. Exprese z ostatních 4 alternativních promotorů je monoalelická, kdy je specificky metylovaná alela od otce či od matky. Např. transkript vznikající z paternální alely alt. promotoru AB umlčuje expresi z paternální alely GSα v imprintovaných tkáních, zřejmě na základě přesné homologie exonů 2-13.

2. vyšetření, materiál, metody:

Vyšetření germinálních mutací GNAS genu musí indikovat klinický genetik po provedení klinického vyšetření pacienta.

vyšetřenímateriálmetody
germinální mutace malého rozsahu v genu GNASperiferní krev pro izolaci gDNAPCR a přímé sekvenování kódujících oblastí všech exonů a přilehlých částí intronů, alt. Sekvenování nové generace (NGS)
germinální mutace velkého rozsahu a metylace v genu GNASperiferní krev pro izolaci gDNAMLPA test ME031, fragmentační analýza, alt. Sekvenování nové generace (NGS)

3. odběr, uskladnění a transport materiálu:

materiálodběrová zkumavka / fixacemnožství odebraného materiáluskladování zkumavky před odběremskladování zkumavky po odběrumax. čas do transportupoznámky
periferní krev pro izolaci gDNAvakueta s EDTA1mLpokojová teplota2-8°C7 dní
vakueta Streck **
"Cell-Free DNA BCT®"
8mL/2mLpokojová teplotapokojová teplota14 dnípo odběru vakuetu 10x otočit tam a zpět
** vakuetu Vám dodá naše laboratoř
pozn: transport materiálu z Vaší ambulance k nám zajistí naše laboratoř, kontaktní osoba: Petr Grossman, tel: +420 731 169 303, grossman@medima.cz

4. klinická senzitivita:

Inaktivační mutace v exonech e1-13 genu GNAS bývají nelezeny až u 80% případů PHP1a a PPHP (Lemos & Thakker 2015). Kombinací přímého sekvenování gDNA (všech exonů a přilehlých intronových úseků) a MLPA ME031 testu jsme schopni zachytit zhruba 90 % známých mutací genu GNAS.

5. analytická senzitivita a specifita:

Analytická senzitivita a specifita Sangerova sekvenování: 99%

Analytická senzitivita MLPA 90%, specifita 98%

Analytická senzitivita a specifita NGS: ..........

6. limitace vyšetření:

Mutace hluboko v intronových a regulačních sekvencích nebudou zachyceny. Vzácné polymorfismy v místě nasedání primerů nebo prob mohou způsobit diagnostickou chybu. Vzhledem k vysoce bohaté GC oblasti prvního exonu genu GNAS1 je sekvenována pouze jeho část - a to 74% exonu 1. V této nesekvenované oblasti (tj. v pozicích 1 – 20 a 124 – 139 cDNA a přilehlém exon-intronovém spoji) se dle veřejně dostupné verze mutační databáze HGMD vyskytuje 8% všech kauzálních mutací.

7. akreditace a kvalita:

Sangerovo sekvenování: ISO 15189

MLPA testy: ME031 - RUO

NGS:

U zmíněných testů provádíme interní validace s ohledem na doporučení k ISO 15189.

8. reference

  • Lemos MC, Thakker RV. GNAS Mutations in Pseudohypoparathyroidism Type 1a and Related Disorders. Human Mutation. 2015;36(1):11-19.
  • Bastepe M. The GNAS locus and pseudohypoparathyroidism. Adv Exp Med Biol. 2008;626:27-40.
  • Thiele S. et al. From Pseudohypoparathyroidism to inactivating PTH/PTHrP Signalling Disorder (iPPSD), a novel classification proposed by the European EuroPHP network. Eur J Endocrinol. 2016;175(6):P1-P17.