Služby - Molekulární genetika

Z hlediska lidské patologie jsou polyomaviry zkoumány jako onkogenní viry od svého objevení (1953). Byly popsány dva lidské polyomaviry a to BK virus a JC virus. U značné části populace, až u 60%, dojde k primoinfekci v dětství, nejčastěji se symptomy infekce horního dýchacího traktu, u 70% dospělých jsou detekovatelné protilátky proti jednomu z nich nebo oběma. Předpokládá se, že po primoinfekci oba viry mohou persistovat inaparentně v ledvinách a pravděpodobně i v B-lymfocytech. K reaktivaci virů dochází zejména u pacientů s poruchami buněčné imunity (HIV, transplantovaní pacienti apod.), ale např. i v období gravidity.

JC virus je u imunosuprimovaných pacientů jako etiologický agens spojován především s progresivní multifokální leukoencefalopatií (PML).

BK virus je detekován u transplantovaných pacientů s diagnózou stenózy ureteru nebo hemorrhagické cystitidy. Kromě toho byl BK virus nalezen v některých novotvarech např. gliomech, neuroblastomech apod.

Opičímu viru SV40 byla věnována značná pozornost díky tomu, že jeho sekvence byly detekovány v poliovirové vakcině připravované na kultuře opičích buněk. Na přelomu padesátých a šedesátých let proběhlo množství studií, které neprokázaly souvislost tohoto faktu se zvýšenou incidencí ependymomu a ostatních mozkových nádorů, osteosarkomu nebo mezotheliomu. V současné době ale byly sekvence T-antigenu SV40 detekovány ve značné míře v populaci právě v těchto typech karcinomů a to obrátilo znovu pozornost k roli SV 40 v lidské patogenezi.

Z virologického hlediska tvoří polyomaviry samostatnou čeleď Polyomaviridae, jsou to relativně malé viry s neobalenou kapsidou o průměru 45 nm, která je složená ze 72 pentamerických kapsomer. Jejich genom je tvořen dvouvláknovou cirkulární dna o velikosti asi 5000pb, společně s některými buněčnými histonovými proteiny organizovanou do formy podobné chromatinu. Obsahuje časné geny které kódují malý t-antigen, velký T-antigen a v některých případech střední T-antigen (polyoma) a pozdní geny, které kódují kapsidové proteiny V1, V2 a V3. T - antigen je schopen interagovat s buněčnými regulačními proteiny (p53, p107, pRb) a podílet se na transformaci a imortalizaci hostitelské buňky.

Vstup viru do buňky se uskutečňuje po adsorpci na povrchu buňky endocytózou, v buněčném jádře se po transkripci a translaci syntetizují T-antigeny a po jejich reakci s buněčnými replikačními faktory ostatní časné proteiny.

Infekce probíhá dále produktivně nebo neproduktivně, v permisivních buňkách probíhá produktivní infekce, tzn. že dochází k syntéze infekčních virových partikulí a jejich uvolnění je spojené se zánikem buňky, v nepermisivních buňkách po syntéze T-antigenů nenásleduje syntéza virové DNA, ale v některých případech dochází k nádorové transformaci buňky.

JC a BK virus detekujeme ve vzorcích moči, krve i fixované nebo nefixované tkáně a to prostřednictvím PCR nebo real-time quantitative PCR (RQ-PCR).

1. BK virus detekujeme pomocí PCR za použití primerů Pol1s a Pol2as15, které amplifikují produkt z oblasti VP2 genu o velikosti 131 bp (obr. 1). Kvantifikační reakce je prováděna pomocí kitu Q-BKV Real Time Systém (Nanogen) na přístroji Rotor Gene 3000 (Corbett Research). (obr. 2a, 2b)
2. JC a BK virus také detekujeme prostřednictvím seminested PCR s vnějšími primery F a R amplifikujícími 176 bp dlouhý úsek JC i BK viru v oblasti T - antigenu a v dalším kroku kombinací primeru F z prvního kola a specifického primeru pro JC resp. BK virus. Amplifikují se virus specifické fragmenty 146 resp. 149 párů bazí.

SV40 detekujeme ve vzorcích fixované i nefixované tkáně

1. pomocí PCR s primery amplifikujícími segment 105 bp v N-terminální oblasti genu T-Ag, pro DNA izolovanou z fixované tkáně v modifikaci dvoustupňové PCR, kdy první část amplifikace probíhá při "low stringency" podmínkách, tedy nižší Tm a druhá při "high stringency", tedy při přísně specifickém Tm.
2. pomocí seminested PCR, kdy v prvním kroku amplifikujeme oblast genu T-Ag o velikosti 287 párů bazí a ve druhém kroku s použitím identického forward-primeru úsek o velikosti 172 párů bazí v této oblasti.

Pozitivitu potvrzujeme sekvenací

Obrázek 1
Agarózový gel s produkty jednoduché PCR. Reakce v duplikátech. 1, 2- negativní vzorky, 3- pozitivní vzorek, 4- negativní kontrola, 5- pozitivní kontrola, 6- měřítko

Obrázek 2
Výsledky kvantifikační Real Time PCR. Specifická sonda pro sekvenci velkého T antigenu BK viru je značena fluoroforem FAM, který je aktivován po hybridizaci na produkt BKV při amplifikační reakci (2a). Titr DNA BK viru vzorku se určí z kalibrační křivky vytvořené ze standardů o známých koncentracích (2b).

a)

b)

1. Arthur RR, Dagostin S, Shah KV. Detection of BK virus and JC virus in urine and brain tissue by the polymerace chain reaction. J Clin Microbiol. 1989;27(6):1174-9.
2. Nickeleit V, Hirsch HH, Binet IF, Gudat F, Prince O, Dalquen P, Thiel G, Mihatsch MJ. Polyomavirus infection of renal allograft recipients: from latent infection to manifest disease. J Am Soc Nephrol. 1999;10(5):1080-9.
3. Nickeleit V, Klimkait T, Binet IF, Dalquen P, Del Zenero V, Thiel G, Mihatsch MJ, Hirsch HH. Testing for polyomavirus type BK DNA in plasma to identify renal-allograft recipients with viral nephropathy. N Engl J Med. 2000;342(18):1309-15.
4. Fields. Virology (fourth edition). Lippincot Williams & Wilkins, 2001
5. Whiley DM, Mackay IM, Sloots TP. Detection and differentiation of human polyomaviruses JC and BK by LightCycler PCR. J Clin Microbiol. 2001;39(12):4357-61.
6. Leung AY, Chan M, Tang SC, Liang R, Kwong YL.Real-time quantitative analysis of polyoma BK viremia and viruria in renal allograft recipients. J Virol Methods. 2002;103(1):51-6.
7. Shivapurkar N, Harada K, Reddy J, Scheuermann RH, Xu Y, McKenna RW, Milchgrub S, Kroft SH, Feng Z, Gazdar AF. Presence of simian virus 40 DNA sequences in human lymphomas. Lancet. 2002 Mar 9;359(9309):851-2.
8. Lednicky JA, Butel JS. Consideration of PCR methods for the detection of SV40 in tissue and DNA specimens. Dev Biol Stand. 1998;94:155-64. Review.
9. Montesinos-Rongen M, Besleaga R, Heinsohn S, Siebert R, Kabisch H, Wiestler OD, Deckert M. Absence of simian virus 40 DNA sequences in primary central nervous system lymphoma in HIV-negative patients. Virchows Arch. 2004 May;444(5):436-8. Epub 2004 Mar 24.