Služby - Molekulární genetika

Lidské papillomaviry jsou známy jako potenciálně onkogenní viry v souvislosti s četnými onemocněními kůže a sliznic, nejznámější je jejich souvislost s karcinomem cervixu a prekancerózními stavy, kde jsou prokázaným hlavním, i když ne jediným etiologickým faktorem a jejich diagnostika je součástí preventivních skríningových programů stejně nezbytně jako cytologie.

Z kožních onemocnění souvisejících s HPV lze uvést různé formy verukózních lézí, genodermatózní onemocnění epidermodysplazia veruciformis, z lézí slizničních kromě prekanceróz a karcinomu děložního hrdla jsou do souvislosti s papillomaviry dávány léze vulvární a vaginální, léze mužského urogenitáního traktu, orofaryngeální, přítomnost papillomavirů byla prokázána také v lézích průdušek, očních spojivek a jícnu. Podle schopnosti navodit onkogenní transformaci infikované buňky se HPV dělí na tzv. nízkorizikové (low risk, LR) a vysokorizikové (high risk, HR) typy.

Z virologického hlediska tvoří papillomaviry dnes již samostatnou čeleď Papillomaviridae, dodnes jich bylo popsáno více než sto typů, patří mezi relativně malé viry, kapsida o průměru asi 55nm je tvořena 72 penta- nebo hexavalentními kapsomerami, které jsou formovány v ikosahedrální kapsidě. Jejich genom tvoří cirkulární dsDNA, která obsahuje geny pro časné (early, E) a pozdní (late, L) proteiny, kromě toho obsahuje nekódující oblast (LCR, URR) tvořenou regulačními sekvencemi. Proteiny exprimované z časných genů iniciují počátek replikace virového genomu v buňce (E1, E2) a mohou se podílet na maligní transformaci buňky (E6, E7), geny L1 a L2 kódují majoritní a minoritní kapsidový protein.

Jeden ze dvou hlavních onkoproteinů, pE6 se váže na tumorsupresorový protein p53, což vede k jeho ubiquitinem zprostředkované degradaci. V důsledku toho dochází ke změně kontroly buněčné proliferace a změněná exprese buněčných regulačních proteinů způsobuje aktivaci telomeráz a tedy imortalizaci buněk.

Onkoprotein E7 váže nefosforylovanou formu pRb a příbuzných proteinů p107, p130. U HR typů má pE7 schopnost vázat komplex E2F/cyklinA, což koreluje s transformačním potenciálem jednotlivých typů. Imortalizace buňky je na pRb nezávislá.

Pro HPV je typická druhová a tkáňová specifita. Ačkoliv kromě lidských existuje řada zvířecích papillomavirů, nebyl dosud popsán jejich mezidruhový přenos.

Tkáňová specifita se týká jejich schopnosti infikovat výhradně mitoticky aktivní buňky bazálního epitelu kůže a sliznic. Přenos infekčních virových partikulí se děje prostřednictvím přímého kontaktu infikovaného a neinfikovaného jedince, autoinokulací, infekční virové částice byly také nalezeny na gynekologických nástrojích a plochách ordinace, spodním prádle, ve školních šatnách a sprchách, fitness, plaveckých bazénech.

Vstup do buňky, v případě HPV penetrace, je zprostředkován vazbou attachment proteinu viru (anti-receptorového) na buněčný receptor, která způsobuje nevratné změny ve struktuře virionů. Hlavní podíl na interakci virus - buňka má α6β4 integrinový komplex exprimovaný specificky na povrchu buněk bazální epiteliální vrstvy.

Další vývoj infekce je možný dvěma směry - produktivní v keratinocytech, kde dochází postupně až k syntéze maturovaných infekčních partikulí, genom zůstává v epizomální formě, nebo neproduktivní - transformující v buňkách slizničního epitelu, kde nastává exprese pouze časných proteinů, popřípadě, u infekce HR typy, maligní transformace buňky. V pokročilejším stádiu onemocnění pak dojde k integraci virového genomu do genomu buňky.

Výběr vhodného detekčního systému je závislý na lokalizaci léze (kožní x slizniční typy) a materiálu, ve kterém je detekce prováděna (fixovaný x nefixovaný). Pro gynekologický screening používáme Digene Hybrid Capture 2 systém.

V rámci PCR existují různé systémy primerů pro amplifikaci fylogeneticky příbuzných skupin typů cílené do různých genů. Jedná se o primery obecné nebo degenerované, amplifikující buďto převážně kožní nebo převážně slizniční typy, v jednoduché nebo nested PCR.

Existují různé systémy primerů pro amplifikaci fylogeneticky příbuzných skupin typů cílené do různých genů. Jedná se o primery obecné nebo degenerované, amplifikující buďto převážně kožní nebo převážně slizniční typy, v jednoduché nebo nested PCR.

Obvykle se používají primery cílené do oblasti L1 genu, který je relativně sekvenčně konzervovaný a tedy spolehlivě využitelný pro typizaci.

Podle druhu testovaného materiálu a způsobu jeho případné fixace a souvisejícího možného poškození DNA volíme primery amplifikující kratší nebo delší oblast.

V naší laboratoři máme k dispozici následující primery:

Produkty PCR analyzujeme reverzní hybridizací (obr. 1) nebo sekvenováním, přímo prokazujeme přítomnost virové DNA hybridizací in-situ.

Přítomnost HPV vyšetřujeme ve vzorcích nativních tkání i tkání fixovaných, stěrech, biopsiích a lavážích.

Obrázek 1
Příklad identifikace některých typů HPV za použití PCR s primery SPF a reverzní hybridizace (LBP/INNO-LiPA HPV genotyping assay). 1 - reaktivní próba 3 odpovídající HPV 16, 2 - reaktivní próby 6, 7 odpovídající HPV 31, 3 - reaktivní próby 1, 28 odpovídající HPV 6

1. Manos MM, TingY, Wright DK, Lewis AJ, Broker TR, Wolinsky SM. Use of polymerase chain reaction amplification for the detection of genital human papillomaviruses. Cancer Cells. 1989;7:209-214
2. Van Ranst M, Kaplan JB, Burk RD.: Phylogenetic classification of human papillomaviruses: correlation with clinical manifestations. J Gen Virol. 1992;73:2653-60
3. Tieben LM, Schegget J, Minnaar RP, et al. Detection of cutaneous and genital HPV types in clinical samples by PCR using consensus primers. J Virol Method 1993;42:265-80
4. Gross GE, Barraso R (eds.): Human papilloma virus infection: a clinical atlas. Ullstein Mosby, 1997.
5. Majewski S, Jablonska S. Human papillomavirus-associated tumors of the skin and mucosa. J Am Acad Dermatol. 1997;36(5 Pt 1):659-85; quiz 686-8. Review.
6. Qu W, Jiang G, Cruz Y, Chang CJ, Ho GY, Klein RS, Burk RD. PCR detection of human papillomavirus: comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer systems. J Clin Microbiol. 1997;35(6):1304-10.
7. Kleter B, Van Doorn LJ, Schrauven L, Molijn A, Sastrowijoto S, Ter Schegget J, Lindeman J, Ter Harmsel Bram, Burger Matthe, Quint W. Development and Clinical Evaluation of a Highly Sensitive PCR-Reverse Hybridization Line Probe Assay for Detection and Identification of Anogenital Human Papillomavirus. J Clin Microbiol. 1999;37:2508-2517
8. Syrjänen K, Syrjänen S.: Papillomavirus infection in Human Pathology. John Wiley&Sons,LTD, England, 2000.
9. Fields. Virology (fourth edition). Lippincot Williams & Wilkins, 2001
10. Sterling JC, Tyring SK.: Human papillomaviruses - clinical and scientific advances. Arnold, 2001.
11. Srinivasan M, Sedmak D, Scott J. Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. Am J Pathol. 2002;161:1961-1971