Služby - Molekulární genetika

Molekulárně biologické analýzy genů kódujících řetězce imunoglobulinů (Ig) a genů kódujících receptory pro antigen T-buněk (T-cell receptor, TCR) jsou velice užitečnými metodami, které napomáhají v diagnostice a klasifikaci lymfoproliferativních onemocnění.

V letech 1997-2008 jsme vyšetřili B či T klonalitu u více než 8000 pacientů.

Pro pochopení principu molekulárně biologických metod detekujících klonalitu B buněk je nezbytné nejprve vysvětlit mechanismus přestavby imunoglobulinových genů.

Genetická informace pro imunoglobuliny (Ig) není děděna v definitivní podobě, ale ve formě genových segmentů, jejichž spojováním se podle vývojového programu organismu vytvoří během diferenciace lymfocytů příslušné komplexní geny, jejichž informace je překládána do primární struktury jedné molekuly lehkého nebo těžkého řetězce. Do funkční podoby jsou komplexní geny uvedeny pouze v B-lymfocytech, kde proběhne přestavba genů pro těžké (IgH) a lehké řetězce (IgL). Proces přestavby probíhá pro těžké i lehké řetězce Ig podobně.

Pro přestavbu obecně platí princip alelické exkluze, což v případě genu pro IgH znamená, že proces proběhne pouze na jednom chromozómu 14. Vzácněji nacházíme v nádorové populaci bialelickou rearanži. Byla však popsána i přestavba ve třech alelách u pacienta s trisomií chromozómu 14.

Izotypická exkluze znamená, že v každém klonu B-lymfocytů se syntéza řetězců typu κ a λ vzájemně vylučuje, t. j. tvoří se v něm jen jeden typ lehkého řetězce.

Genový komplex pro IgH se nachází na dlouhém raménku 14. chromozómu (v oblasti 14q32.33). Komplex se skládá z několika typů segmentů, které odpovídají za příslušné části molekuly těžkého řetězce protilátky a nesou tedy stejné označení - V-variabilní (variable), D - diverzitu neboli různost zajišťující (diversity), J-spojovací (joining) a dále ještě C- konstantní (constant). Během přestavby genu IgH (zkráceně přestavby IgH) je z mnohočlenných skupin segmentů původního genového komplexu náhodně vybráno z každé skupiny vždy po 1 segmentu a ty jsou pak spolu spojeny. Přestavba je složitý proces s velkou možností kombinací, jež je navíc podpořena nepřesnostmi ve spojení jednotlivých segmentů, jejichž výsledkem je unikátní sekvence DNA. V další fázi vývojového programu potom k různorodosti B-lymfocytů a protilátek přispívají somatické mutace při imunitní odpovědi.

Část genového komplexu kódující variabilní oblast protilátky obsahuje 4 konzervativní (framework) oblasti, označované jako FR I - FR IV, mezi něž jsou vloženy 3 vysoce variabilní úseky, které zajišťují komplementaritu (complementarity determining regions, CDR). Přestavba IgH začíná v časné pro-B-buňce, kdy dojde na několika místech genového komplexu k přerušení. Dále je vybráno vždy po jednom ze skupiny 27 D a ze 6 J segmentů a jsou spolu spojeny. V pozdní pro-B-buňce je pak rearanžovaný oddíl DJ zvětšen přidáním jednoho ze segmentů V (obr. 1).

Obrázek 1

Rozpoznávací místa DNA v průběhu přestavby jsou určena sekvencemi 7 a 9 párů bazí (heptamery a nonamery), jež jsou rozpoznávány dvěma proteiny aktivujícími rekombinaci (recombination activating proteins 1, 2). Mezi nonamery a heptamery se nacházejí mezerníkové sekvence 12 nebo 23 bp, které odpovídají jednomu nebo dvěma závitům šroubovice DNA. Na obou koncích každého segmentu, jenž má být zapojen do přestavby, se nachází jedna z mezerníkových sekvencí. Spojování segmentů je pak možné pouze způsobem, kdy jsou k sobě připojeny vždy sekvence 12 bp a 23 bp. Na obou koncích segmentu D jsou mezerníkové sekvence o 12 bp, zatímco na 3´- konci regionu V a na 5´- konci segmentu J se nacházejí sekvence 23 bp. Z toho vyplývá, že jsou umožněna jen spojení mezi D a J a dále mezi V a D, zatímco V a J spolu spojeny být nemohou.

Variabilita a specifita produktu přestavby je zvyšována ještě adicí nukleotidů na obou koncích segmentu D (v tzv. zónách N) terminální deoxynukleotidyltransferázou. Výsledná přestavba je unikátní a charakteristická pro danou buňku a elementy z ní pocházející. Aby vznikl kompletní kód pro těžký řetězec imunoglobulinu, musí být samozřejmě zapojena ještě konstantní oblast.

Přídatné inzerce a delece nukleotidů nejsou pouze vítaným zdrojem variability, ale mohou vytvořit i stopkodon anebo posunout čtecí rámec, takže je přestavba neproduktivní, neumožňuje vznik funkčního proteinu. Proces přestavby se v takovém případě může opakovat na druhém chromozómu, a je-li opět neúspěšný, buňka se apoptoticky odstraní.

Genový komplex kódující lehký řetězec kappa leží na chromozómu 2 v oblasti p12, informace pro řetězec lambda leží na chromozómu 22 v oblasti q11. Přestavba IgL probíhá ve stádiu pre-B-buňky obdobným způsobem jako rearanže IgH. Je však jednodušší, neboť zde nejsou segmenty D. Po přestavbě IgH proběhne nejprve přestavba kappa, poté přichází eventuálně na řadu komplex kódující řetězec lambda.

Normální situace v organismu odpovídá polyklonalitě, čili přítomnosti vysokého počtu klonů s odlišnými přestavbami, což tělu umožňuje reagovat na velké množství antigenů. B-lymfomy jsou nádorové proliferace vycházející z jedné transformované buňky, jejíž potomci mají stejnou genetickou výbavu, kterou je možno v oblasti IgH identifikovat Southernovým blotem (po naštěpení příslušnými restrikčními endonukleázami) nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). První technika vyžaduje velké množství vysokomolekulární DNA a tudíž je její použití v rutinní diagnostice značně omezeno. PCR naopak umožňuje, díky mnohonásobnému namnožení zkoumaného úseku DNA, i vyšetření archivního materiálu. Primery pro PCR jsou komplementární k částem konzervativních oblastí genu pro IgH. Tato základní molekulárně-genetická vyšetření lymfoproliferací pomáhají patologům řešit otázku malignity a otázku příslušnosti patologického procesu k B-či T-linii.

Informace o monoklonalitě patologického procesu pomáhá v diagnostice obtížných případů, někdy i v situaci, kdy jsou ostatní (morfologická a imunohistochemická) kritéria obtížně hodnotitelná, např. v rozsáhle nekrotických tkáních. Identifikace monoklonální populace významně přispívá ke stanovení diagnózy maligní lymfoproliferace, i když je nutné mít stále na mysli, že ne vždy je monoklonalita totožná s malignitou. Obezřetnost je například na místě při hodnocení klonálních pruhů získaných vyšetřením PCR u vzorků gastritid. Monoklonální pruhy mohou být rovněž přítomny, amplifikujeme-li DNA izolovanou ze tkáně obsahující pouze malý počet lymfoidních (byť zánětlivých) buněk.

Populace s monoklonální přestavbou IgH náleží většinou k B-linii. V rozsáhlých studiích imunoglobulínového receptoru a receptoru T-lymfocytu byl však zjištěn i tzv. fenomén nevěry k příslušné linii ("lineage infidelity"), kdy např. nádorová buňka náležící podle jiných atributů k T-linii vykazuje monoklonální přestavbu IgH. Byla popsána i současná přítomnost přestavby IgH a TCR.

Kromě popsaných aplikací při vyšetření problematických biopsií je sensitivní vyšetření přestavby IgH pomocí PCR používáno pro staging a monitoraci pacientů s B-lymfomy nebo leukemiemi, obzvláště pro sledování minimální reziduální choroby.

Zjednodušeně lze říci, že monoklonální proces je většinou (ale ne vždy!) maligní, polyklonální proces spíše benigní. V patologické diagnostice je samozřejmě vždy nutné výsledky molekulární genetiky hodnotit v kontextu ostatních vyšetření.

Záchytnost metody - jaké procento skutečně klonálních lymfoproliferací dokáže metoda odhalit? Obecně mezi 60% až 100 %. To však značně závisí také na vlastnostech analyzované tkáně: vysoká záchytnost je u B-chronické lymfatické leukémie/respektive lymfomu z malých B-lymfocytů, lymfomu z plášťových buněk a leukémii z vlasatých buněk (až ve 100%), výrazně nižší je u folikulárního lymfomu, MALT lymfomů a akutní lymfoblastické leukémie. Detekce monoklonality IgH pomocí PCR se zvyšuje použitím několika typů reakcí.

Citlivost metody: populace s klonální přestavbou IgH by měla být odhalena, tvoří-li aspoň 5% buněk vzorku.

V naší laboratoři je analýza klonality IgH založena na polymerázové řetězové reakci (PCR). PCR metody amplifikují hypervariabilní část regionu VDJ a používají primery specifické k relativně konzervovaným oblastem FR1, FR2, FR3 a JH (obr. 2). Amplifikované produkty jsou pak rozděleny na agarózovém gelu s vysokou rozlišovací schopností (high resolution agarose). Klonální populace vytvoří zřetelný ostrý proužek, kdežto polyklonální populace se projeví jako smear složený z fragmentů různých velikostí (obr. 3).

Ve sporných případech pak ještě využíváme fragmentační analýzu fluorescenčně značených PCR produktů (obr. 4).

Obrázek 2

Obrázek 3
Hight resolution agarose gel: Vzorek 1- monoklonální populace tvoří zřetelný ostrý proužek, vzorek 2- polyklonální populace se projeví jako smear složený z fragmentů různé velikosti, 3- marker.

Obrázek 4
Fragmentační analýza –FR2 reakce: Vzorek 1 : Monoklonální populace- jeden zřetelný produkt, vzorek 2- polyklonální populace.- více produktů

Lymfomy z T-buněk jsou vzácné, představují pouze kolem 12% nehodgkinských lymfomů. Diagnostika je obtížná a vyžaduje kompilaci morfologických, imunohistochemických a molekulárně-genetických metod. Z posledně zmíněných je nejdůležitější detekce klonality T buněk, která využívá variabilitu antigenových receptorů T-buněk (TCR). V principu je podobná metodě IgH. Genový komplex kódující TCR gamma se u člověka nacházejí na chromozómu 7 v oblasti p15-p14 a skládá se ze segmentů Vg, Jg a Cg, které jsou během vývoje T buněk náhodně přeskupovány (obr. 5).

Obrázek 5

Obrázek 6

Analýza klonality T buněk využívá PCR amplifikace hypervariabilní části genu pro receptor T-lymfocytu gama (TCR gamma). Provádí se dvě různé multiplex PCR se směsí flourescenčně značených primerů, které jsou komplementární V a J gamma segmentům. Fragmentační analýza PCR produktů se provádí na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3130xl a je vyhodnocena programem GeneMapper (obr. 7).

Obrázek 7
Fragmentační analýza - TCR gamma-B reakce: Vzorek 1 : Monoklonální populace - jeden zřetelný produkt, vzorek 2 - polyklonální populace - více produktů.

1. Trainor KJ, Brisco MJ, Wan JH, Neoh S, Grist S, Morley AA. Gene rearrangement in B- and T-lymphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction. Blood. 1991;78(1):192-6.
2. Aubin J, Davi F, Nguyen-Salomon F, Leboeuf D, Debert C, Taher M, Valensi F, Canioni D, Brousse N, Varet B, Flandrin and Macintyre EA. Description of a novel FR1 IgH PCR strategy and its comparison with three other strategies for the detection of clonality in B cell malignancies. Leukemia. 1995;9(3):471-9.
3. Menke MA, Tiemann M, Vogelsang D, Boie C, Parwaresch R. Temperature gradient gel electrophoresis for analysis of a polymerase chain reaction-based diagnostic clonality assay in the early stages of cutaneous T-cell lymphomas. Electrophoresis. 1995;16(5):733-8.
4. Miettinen M, Lasota J. Polymerase chain reaction based gene rearrangement studies in the diagnosis of follicular lymphoma--performance in formaldehyde-fixed tissue and application in clinical problem cases. Pathol Res Pract. 1997;193(1):9-19.
5. Müller-Hermelink HK, Greiner A: Molecular analysis of human immunoglobulin heavy chain genes (IgVH) in normal and malignant B cells. Am J Pathol. 1998;153(5):1341-6.
6. World Health Organisation Classification of Tumours: Pathology and Genetics. Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Ed. Jaffe, ES, Harris, NL, Stein, H, Vardiman JW. IARC Press, Lyon, 2001.
7. Ahnhudt C, Muche JM, Dijkstal K, Sterry W, Lukowsky A. An approach to the sensitivity of temperature-gradient gel electrophoresis in the detection of clonally expanded T-cells in cutaneous T-cell lymphoma. Electrophoresis. 2001;22(1):33-8.