Služby - Molekulární genetika

Nejčastější formou dědičného kolorektálního karcinomu je Lynchův syndrom, tedy hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC). Pacienti s Lynchovým syndromem mají ale také zvýšené riziko vzniku nádorů urogenitálního traktu a dalších tumorů. Dědičnost je u tohoto onemocnění autozomálně dominantní. Příčinou vzniku Lynchova syndromu je zárodečná mutace v některém z genů zodpovědných za opravy replikačních chyb v DNA (mismatch repair genes-MMR geny), což má za následek vznik nádorů charakteristických vysokým stupněm nestability v krátkých tandemových repeticích molekuly DNA (mikrosatelitech). Tyto tumory jsou proto označovány jako MSI-H (microsatellite instability-high). Vodítkem k nalezení mutovaného genu je imunohistochemické vyšetření exprese MMR proteinů hMLH1, hMSH2, hMSH6 a hPMS2. Gen se ztrátou exprese je následně podroben vyšetření přímým sekvenováním. K diferenciální diagnostice se u MSI-H tumorů využívá také detekce mutace genu BRAF (V600E). U Lynchova syndromu se tato mutace nevyskytuje.

Podskupinou HNPCC je Muir-Torre syndrom (MTS), charakteristický výskytem benigních a maligních sebaceózních kožních nádorů v kombinaci s interními malignitami. Vysokou mikrosatelitní nestabilitu vykazuje přibližně 70% těchto nádorů. Na vzniku MTS se podílí především mutace v genech hMLH1 a hMSH2, přičemž zárodečná mutace v genu hMSH2 je převažující (90%).

MMR proteiny se spojují do funkčních komplexů, a to v hMSH2-hMSH6 heterodimer a hMLH1-hPMS2 heterodimer. První z těchto dimerů rozpoznává chyby v DNA a signalizuje poškození, druhý chyby opravuje. Zároveň se podílí na zastavení buněčného cyklu a indukci apoptózy v reakci na poškození DNA.

Gen hMLH1 je lokalizován na chromozomu 3 v oblasti p21.3 a má 19 exonů. Na chromozomu 2 je v oblasti p21 – 22 lokalizován gen hMSH2, obsahující 16 exonů, a v oblasti p16 gen hMSH6, skládající se z 10 exonů. Gen hPMS2 se nachází v chromozomální oblasti 7p22.

Fragmentační analýzou provádíme vyšetření mikrosatelitní nestability pěti monukleotidových (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24, MONO-27) a tří dinukleotidových repeticí (D2S123, D17S250, D5S346), tedy rozšířený Bethesda panel. Zároveň detekujeme mutace v kódujících oblastech MMR genů hMLH1, hMSH2 a hMSH6, které jsou z více než 95% příčinou Lynchova syndromu. Primery pro PCR amplifikaci jsou navrženy tak, aby bylo možné detekovat i případnou mutaci místa sestřihu. PCR produkty analyzujeme přímou sekvenací. Rozsáhlé delece, které představují 12-15% nalezených mutací, a případné metylace promotorů MMR genů vyšetřujeme pomocí MLPA kitů. Vyšetření lze provést z tkáně (zmražené i FFPE) a krve.