Služby - Molekulární genetika

Monoklonalita je považována za základní charakteristiku neoplázií. Detekce mono či polyklonality může tedy hrát významnou roli při odlišení některých maligních neoplásií, které jsou v drtivé většině monoklonální, od polyklonálních reaktivních lézí. Pro analýzu klonality byla vyvinuta řada metodik. Jednou z nich je i metoda, jež využívá fenoménu zvaného lyonizace, tj. náhodné inaktivace chromozómu X metylací u osob s XX sadou chromozómů. Teorie praví, že během ranné embryogeneze každá buňka, aby vykompenzovala genovou dávku ze dvou rodičovských chromozómů X, náhodně jeden z nich metyluje. Předpokládá se, že tato metylace je ireverzibilní a obdobný, tj. metylovaný paternální či maternální chromozóm, dědí i všechny dceřiné buňky. U normální tkáně osoby ženského pohlaví je tedy v naprosté většině případů poměr metylovaných chromozómů přijatých od matky a od otce zhruba stejný. Oproti tomu u neoplazií, kde v populaci buněk vzešlé z jedné mateřské nádorové buňky zůstává metylovaný stále stejný chromozóm, dochází k převážení původního metylačního poměru směrem k paternálnímu či maternálnímu chromozómu X. Jednou z analýz, která tuto nerovnováhu detekuje, je i metoda, využívající lokusu HUMARA a metylačně senzitivních restrikčních enzymů.

Lokus pro human androgen receptor (HUMARA) je umístěn na chromozómu X v oblasti q13. Jeho první exon obsahuje trinukleotidový (CAG) short tandem repeat (STR) o poměrně značné variabilitě (heterozygozita cca 90 %). Tento STR leží v blízkosti 5´ promotoru genu HUMARA, který ve vysoké frekvenci obsahuje CpG dinukleotidy, tzv. CpG ostrůvky. Test využívá metody polymerázové řetězové reakce (PCR), vysoké variability lokusu HUMARA a specifických vlastností restrikčních endonukleáz HhaI a HpaII, jejichž restrikční místa se nacházejí v CpG ostrůvcích, tj. uvnitř potenciálního amplikonu. Před vlastní PCR se provede štěpení vyšetřované DNA těmito enzymy, které díky své citlivosti na metylovanou DNA štěpí pouze nemetylovaný chromozóm. Při PCR pak dochází k amplifikaci pouze neštěpených, tj. metylovaných sekvencí. Separací štěpených a neštěpených amplikonů na akrylamidovém gelu a jejich porovnáním pak můžeme odlišit monoklonální a polyklonální status vzorku (obr. 1).

Obrázek 1
Princip klonální analýzy za použití PCR a metylačně senzitivních enzymů.

Analýza klonality pomocí testování metylačního statutu chromozómů X v lokusu HUMARA začíná štěpením DNA metylačně senzitivními restrikčními enzymy (HhaI a HpaII). Následuje PCR štěpené a něštěpené DNA se setem primerů značených fluorescenční látkou 6-FAM amplifikující STR HUMARA. Produkty PCR jsou dále separovány pomocí automatického sekvenátoru ABI Prism 3130XL. Fragmentační analýza porovnává patern štěpeného a neštěpeného vzorku (obr. 2).

Obrázek 2
Příklad fragmentační analýzy s monoklonálním paternem u dysplázie (CIN III) cervixu. PCR produkty detekovány pomocí automatického sekvenátoru ABI Prism 3130XL. N - neštěpená DNA, H - DNA štěpená restrikčním enzymem HhaI, P - DNA štěpená restrikčním enzymem HpaII

1. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Feinberg AP. Use of restriction fragment length polymorphisms to determine the clonal origin of human tumors. Science. 1985;227(4687):642-5.
2. Allen RC, Zoghbi HY, Moseley AB, Rosenblatt HM, Belmont JW. Methylation of HpaII and HhaI sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgen-receptor gene correlates with X chromosome inactivation. Am J Hum Genet. 1992;51(6):1229-39.
3. Paradis V, Laurent A, Flejou JF, Vidaud M, Bedossa P. Evidence for the polyclonal nature of focal nodular hyperplasia of the liver by the study of X-chromosome inactivation. Hepatology. 1997;26(4):891-5.
4. Nakamura H, Hirota S, Adachi S, Ozaki K, Asada H, Kitamura Y. Clonal nature of seborrheic keratosis demonstrated by using the polymorphism of the human androgen receptor locus as a marker. J Invest Dermatol. 2001;116(4):506-10.
5. el Hamidi A, Kocjan G, Du MQ. Clonality analysis of archival cervical smears. Correlation of monoclonality with grade and clinical behavior of cervical intraepithelial neoplasia. Acta Cytol. 2003;47(2):117-23.