Služby - Molekulární genetika

Diagnostika klinicky závažných mikroorganizmů se kromě klasických mikroskopických, kultivačních a imunologických technik opírá stále větší měrou i o molekulárně biologické testy. Jejich podstatnou výhodou je rychlost zpracování vzorků a také značná citlivost a specifita.

Pro zpřesnění histopatologické diagnostiky a především pro léčbu pacientů má velký význam zejména molekulárně-genetické vyšetření zánětů s histiocytární či přímo granulomatózní reakcí, neboť podobný histologický obraz může být způsoben celou řadou infekčních agens.

Podle informací WHO je asi 1/3 světové populace infikována bakterií Mycobacterium tuberculosis, každoročně přitom zahubí kolem 3 miliónů pacientů a je tak celosvětově nejčastější smrtící infekcí. Tuberkulóza má nejvyšší výskyt v chudých zemích, ale její incidence významně roste také v zemích vyspělých, zejména v souvislosti s migrací lidí ze zemí třetího světa, infekcí HIV a turistikou.

Vývoj onemocnění je různý, obvykle spíše pomalý. Může postihovat rozličné orgány. Nejčastěji se projevuje v plicní formě (85 %), dále postihuje lymfatické uzliny (5 - 10 %), pleuru, kosti, ledviny, centrální nervový systém, gastrointestinální trakt, pohlavní orgány, atd. Základním typickým histopatologickým nálezem je granulomatózní zánět s kaseózní nekrózou.

Naše laboratoř používá k detekci mykobakterií dvě různé techniky PCR. První metoda je nested PCR sloužící k detekci různých druhů a kmenů rodu Mycobacterium. Amplifikuje část genu kódujícího heat shock protein o hmotnosti 65 kDa, který je vysoce konzervovaný u různých druhů rodu Mycobacterium. Druhá metoda je také nested PCR. Amplifikuje v inzerční sekvenci IS6110. Tato inzerční sekvence se vyskytuje v několika kopiích, a to pouze u druhového komplexu Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti). Metoda je určena k odlišení komplexu Mycobacterium tuberculosis od ostatních druhů mykobakterií. Obě PCR techniky lze využít jak pro vyšetření čerstvých materiálů (tkáň, sputum), tak pro vyšetření tkání fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu.

Podrobnější pojednání o molekulární biologii borrelií naleznete na stránce "Lymeská borrelióza a její původce".

Borrelia burgdorferi patří mezi spirochéty. Typicky je přenášena klíšťaty (vzácně i krev sajícím hmyzem) a způsobuje zoonotické onemocnění lymeskou borreliózu. Nicméně kousnutí infikovaným klíštětem nemusí vždy způsobit nemoc a na druhou stranu se u některých jasně infikovaných pacientů kousnutí klíštětem neprokáže. Lymeská borrelióza je multisystémové onemocnění postihující hlavně kůži, klouby, svaly, centrální nervový systém, eventuálně i srdce a další orgány. Mezi hlavní kožní projevy lymeské borreliózy patří erythema migrans, acrodermatitis chronica atrophicans a tzv. borreliové lymfocytomy neboli pseudolymfomy (v predilekčních místech, jakými jsou oblast prsní bradavky, ušní lalůček, nos nebo oblast šourku). Kožní afekce se mohou však vyskytnout i zcela solitárně bez poškození dalších orgánů. Infekce borreliemi byla dále opakovaně prokázána i u části kožních lymfomů. Pro vznik lymfoproliferace v kůži je důležitý antigenní stimulus infekcí, což je analogické roli Helicobacter pylori při vzniku gastritidy a MALT lymfomu žaludku. V patologické diagnostice kožních lymfoproliferací má detekce borrelií obrovský terapeutický dopad, neboť antibiotika (např. doxycyklin) lézi často zcela vyléčí.

Metoda sloužící k detekci borrelií je nested PCR amplifikující část genu kódujícího 23S rRNA.

Infekce B. henselae způsobuje nemoc z kočičího škrábnutí. Symptomy onemocnění mohou být různorodé, nicméně nejčastějším projevem je granulomatózně-purulentní lymfadenitida. Tento morfologický obraz však není patognomický, může být vyvolán i četnými dalšími agens. Přesná diagnóza proto závisí na citlivých laboratorních testech. Někdy je možné prokázat B. henselae v histologickém řezu podle charakteristického vzhledu po impregnaci stříbrem. Detekce bakteriální DNA je však v diagnostice nedocenitelnou pomocí.

Detekci Bartonella henselae provádíme pomocí PCR amplifikující část oblasti spojující geny pro 16S a 23S rRNA. Metoda umožňuje odlišit podle velikosti výsledného PCR produktu následující druhy rodu Bartonella: B. henselae, B. bacilliformis, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. quintana a B. vinsonii subsp. berkhoffii.

Syfilis je sexuálně přenosné systémové onemocnění způsobené spirochétami T. pallidum subsp. pallidum. Neléčené probíhá typicky ve třech stádiích: primární stadium nastává asi 3 týdny po infekci a zahrnuje vřed v místě vniku infekce a regionální lymfadenopatii. Sekundární stadium (2-10 týdnů po primárním) je charakterizováno difúzním exantémem a enantémem, teplotou, lymfadenopatií, bolestmi hlavy a artritidou. I tyto léze se mohou spontánně vyhojit. Terciární stadium přichází až po letech, kdy aktivní zánět poškozuje především aortu, srdce a centrální nervový systém. Přestože existuje již několik desetiletí účinná léčba, onemocnění stále zůstává globálním problémem. Diagnostika syfilis je komplikovaná, protože T. pallidum nelze v laboratorních podmínkách kultivovat. Přitom identifikace nakažených osob a jejich léčba závisí právě na včasném zachycení nemoci.

Metoda detekující Treponema pallidum je jednokolová PCR amplifikující část genu tmpA. Specifitu amplifikovaného produktu je možno potvrdit restrikčním štěpením pomocí enzymu SmaI.

Tularémie je zoonotické onemocnění způsobené bakteriemi F. tularensis. Na člověka se přenáší typicky z nakaženého zvířete. Může probíhat v několika klinických formách: ulceroglandulární (eventuálně okuloglandulární), plicní (pneumonické), tzv. tyfoidní (horečnaté nespecifické onemocnění, eventuálně až s endotoxinovým šokem), faryngeální, vzácně jako endocarditis či osteomyelitis. Časté bývá postižení lymfatických uzlin. Druh F. tularensis lze rozdělit na tva typy. F. tularensis biovar tularensis, doposud popsaný pouze ze Severní Ameriky a F. tularensis biovar palearctica vyskytující se především v Asii a v Evropě. Diagnostika tularémie je nejčastěji založena na detekci specifických protilátek metodou ELISA, nebo hemaglutinačními testy, avšak byla u nich prokázána i zkřížená reaktivita s jinými poměrně běžnými bakteriemi.

Detekce F. tularensis pomocí molekulárně biologických metod je založena na PCR amplifikující část genu kódujícího membránový protein FopA.

Brucellóza je celosvětově rozšířené onemocnění s několika endemickými ložisky ve středomořské oblasti. Typicky se přenáší buď kontaktem s nakaženými zvířaty, nebo jako nemoc z povolání, možný je i přenos z neošetřeného mléka či mléčných výrobků. Klinický průběh onemocnění je dosti variabilní, v zásadě akutní nebo chronický, jeho diagnostika tudíž závisí na přesných laboratorních testech. Brucella se obtížně kultivuje a je nebezpečná laboratornímu personálu. Ani serologické testy nepřinášejí uspokojivé výsledky.

Detekci Brucella abortus provádíme pomocí nested PCR amplifikující část inzerční sekvence IS711.

Whippleova choroba je vzácné multisystémové onemocnění způsobené intracelulární bakterií Tropheryma whipplei. Klinické projevy jsou různorodé, nejčastěji to bývá malabsorpce tenkého střeva, ztráta hmotnosti, průjem, zvětšení mezenterických lymfatických uzlin, artritida a kožní pigmentace.

Diagnostika Whippleovy choroby spočívá v detekci PAS pozitivních pěnovitých makrofágů ve tkáňových biopsiích, doplněném PCR průkazem infekce T. whipplei. Metoda detekující T. whipplei je jednokolová PCR amplifikující část genu kódujícího 16S rRNA.

Y.enterolitica i Y.pseudotuberculosis jsou gramnegativní tyčinkovité baktérie, fakultativně anaerobní. Jejich primárním hostitelem jsou u Y.enterocoltica teplokrevní savci, ale i ryby a plazi, pro přenos na člověka je nejpodstatnější jejich přítomnost v domácích zvířatech, hlavním rezervoárem jsou prasata. Y.pseudotuberculosis je rozšířena jako parazit mnoha druhů ptáků a savců. Přítomnost obou Yersinií byla detekována díky fekální kontaminaci i ve vodě a zelenině.

Přenos na člověka se uskutečňuje fekálně orální cestou, ať už přímo, nebo díky kontaminaci potravin. Byla též popsána transmise nozokomiální i infikovanou krví. Akutní infekce se manifestuje jako enterokolitida, častá je akutní mezenterická lymfadenitida s charakterem apendicitidy (pseudoappendicitis), horečky, bolesti hlavy, faryngitida, anorexie, zvracení, artritida, kožní ulcerace, osteomyelitida a septikémie. Pro infekci Y.enterocolitica jsou charakteristické projevy gastroenterokolitidy, pro Y.pseudotuberculosis abdominální bolesti, u imunosuprimovaných jedinců je vyšší počet fatálních infekcí. Za normálních okolností je onemocnění úspěšně léčitelné antibiotiky, avšak s častou rezistencí Yersinií k penicilinu a jeho syntetickým derivátům.

Z hlediska molekulární genetiky, konkrétně PCR metodik je podstatná sekvenční homologie pro rozlišení jednotlivých druhů Yersinií. Dobře odlišitelná je Y. enterocolitica, avšak genom Y. pseudotuberculosis vykazuje značnou sekvenční homologii s genomem Y.pestis. Podle některých autorů vznikla Y.pestis recentně (její vznik vyvolal první morovou vlnu přicházející z východního pobřeží Afriky) jako klon Y.pseudotuberculosis, odlišující se dvěma plasmidy, kterými je dána její patogenita a vysoká virulence.

1. Y. enterocolitika - detekujeme pomocí klasické PCR, dva nezávislé páry primerů jsou designovány do oblasti ail genu a amplifikují úseky o velikosti 170 nebo 114 párů bazí.
2. Y. pseudotuberculosis - detekujeme pomocí klasické PCR, dva nezávislé páry primerů amplifikují oblast genu inv o velikosti 295 resp. 114 pb, jeden pár primerů byl designován pro oblast genu ail a amplifikuje úsek o velikosti 123 pb.

Výsledky konfirmujeme sekvenací.

Chlamydia trachomatis jsou gramnegativní bakterie intracelulární bakterie ve vnímavých buňkách sliznic. Přenášena je obvykle pohlavním stykem a může u mužů i u žen způsobit vážné zdravotní komplikace, mezi které patří uretritida, proktitida, záněty prostaty a nadvarlat u mužů, záněty cervixu a malé pánve u žen, neplodnost. U žen může zapříčinit mimoděložní těhotenství a u novorozených dětí nakažených při porodu plicní komplikace a infekci oka – trachom, který je však problémem jen v rozvojových zemích. Diagnostika je nejčastěji založena na detekci specifických protilátek metodou ELISA, může však docházet ke zkřížené reaktivitě s ostatními druhy chlamydií. Kultivace je obtížná vzhledem k nutnosti použít tkáňové kultury. Pro přímý průkaz v tkáních i tělních tekutinách je využíváno molekulárních metod.

Detekci Chlamydia trachomatis provádíme pomocí neakreditované Touchdown Enzyme Time Release-PCR s primery amplifikujícími část genu pro 16S rRNA. Tato PCR je přibližně 10x citlivější než běžné PCR metody.

Chlamydophila psittaci je primárně zvířecí patogen, ale může být přenesen i na člověka, a to většinou kontaminovaným trusem nebo peřím. U člověka může zapříčinit onemocnění probíhající pod obrazem atypické pneumonie (ptačí kmeny) nebo placentitidy (savčí kmeny). Je také asociován s okulárními adnexálními MALT lymfomy. Tato infekce podléhá povinnému hlášení. Diagnostika je nejčastěji založena na detekci specifických protilátek metodou ELISA, může však docházet ke zkřížené reaktivitě s ostatními druhy chlamydií. Kultivace je obtížná vzhledem k nutnosti použít tkáňové kultury. Pro přímý průkaz v tkáních je využívána metoda PCR.

Detekci Chlamydophila psittaci provádíme pomocí neakreditované Touchdown Enzyme Time Release-PCR s primery amplifikujícími část oblasti spojující geny pro 16S a 23S rRNA. Tato PCR je přibližně 10x citlivější než běžné PCR metody.

1. Schwartz JJ, Gazumyan A, Schwartz I. rRNA gene organization in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. J Bacteriol. 1992, 174 (11): 3757-65.
2. Inagaki H, Kawai T, Miyata M, Nagaya S, Tateyama H, Eimoto T. Gastric Syphilis: Polymerase chain reaction detection of treponemal DNA in pseudolymphomatous lesions. Hum Pathol. 1996;27:761-65.
3. Scott MA, McCurley TL, Vnencak-Jones CL, Hager C, McCoy JA, Anderson B, Collins RD, Edwards KM. Cat scratch disease: detection of Bartonella henselae DNA in archival biopsies from patients with clinically, serologically, and histologically defined disease. Am J Pathol. 1996;149(6):2161-7.
4. Ramzan NN, Loftus E Jr, Burgart LJ, Rooney M, Batts KP, Wiesner RH, Fredricks DN, Relman DA, Persing DH. Diagnosis and monitoring of Whipple disease by polymerase chain reaction. Ann Intern Med. 1997;126(7):520-7.
5. Marchetti G, Gori A, Catozzi L, Vago L, Nebuloni M, Rossi MC, Esposti AD, Bandera A, Franzetti F. Evaluation of PCR in detection of Mycobacterium tuberculosis from formalin fixed, paraffin embedded tissues: comparison of four amplification assays. J Clin Microbiol. 1998;36:1512-17.
6. Jensen WA, Fall MZ, Rooney J, Kordick DL, Breitschwerdt EB. Rapid identification and differentiation of Bartonella species using a single-step PCR assay. J Clin Microbiol. 2000;38(5):1717-22.
7. Wicki R, Sauter P, Mettler C, Natsch A, Enzler T, Pusterla N, Kuhnert P, Egli G, Bernasconi M, Lienhard R, Lutz H, Leutenegger CM. Swiss Army Survey in Switzerland to determine the prevalence of Francisella tularensis, members of the Ehrlichia phagocytophila genogroup, Borrelia burgdorferi sensu lato, and tick-borne encephalitis virus in ticks. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000;19(6):427-32.
8. Al Nakkas AF, Wright SG, Mustafa AS, Wilson S. Single-tube, nested PCR for the diagnosis of human brucellosis in Kuwait. Ann Trop Med Parasitol. 2002;96(4):397-403.
9. Hercik K, Melter O, Janecek J, Branny P. In situ detection of Bartonella henselae cells. Mol Cell Probes. 2002;16(1):49-56.
10. Achtman M, Zurth K, Morelli G, Torrea G, Guiyoule A, Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Nov 23;96(24):14043-8. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jul 5;97(14):8192.
11. Lamps LW, Madhusudhan KT, Greenson JK, Pierce RH, Massoll NA, Chiles MC, Dean PJ, Scott MA. The role of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in granulomatous appendicitis: a histologic and molecular study. Am J Surg Pathol. 2001 Apr;25(4):508-15.
12. Lamps LW, Madhusudhan KT, Havens JM, Greenson JK, Bronner MP, Chiles MC, Dean PJ, Scott MA. Pathogenic Yersinia DNA is detected in bowel and mesenteric lymph nodes from patients with Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 2003 Feb;27(2):220-7.
13. Madico G, Quinn TC, Boman J, Gaydos CA. Touchdown enzyme time release-PCR for detection and identification of Chlamydia trachomatis, C. pneumoniae, and C. psittaci using the 16S and 16S-23S spacer rRNA genes. J Clin Microbiol. 2000, 38(3):1085-1093.
14. Chanudet E, Zhou Y, Bacon CM, Wotherspoon AC, Müller-Hermelink HK, Adam P, Dong HY, de Jong D, Li Y, Wei R, Gong X, Wu Q, Ranaldi R, Goteri G, Pileri SA, Ye H, Hamoudi RA, Liu H, Radford J, Du MQ. Chlamydia psittaci is variably associated with ocular adnexal MALT lymphoma in different geographical regions. J Pathol. 2006, 209(3):344-351.